LF200倒置熒光顯微鏡 Calcein AM-PI 活 / 死細胞雙色熒光染色檢測完整解決方案

一、方案概述

1. 檢測原理

Calcein AM-PI 雙染法是經典活細胞活力檢測技術：

·       Calcein AM（綠色熒光，FITC 通道 Ex/Em 494/517nm）：脂溶性小分子穿透完整細胞膜，活細胞內酯酶水解 AM 基團生成帶電荷鈣黃綠素，滯留細胞質發出明亮綠色熒光；死細胞無功能性酯酶，無綠色信號。

·       PI（紅色熒光，TRITC 通道 Ex/Em 535/617nm）：無法穿透完整細胞膜，僅進入膜破損死細胞，結合細胞核核酸發出紅色熒光。

判定標準：

? 活細胞：胞質綠色熒光、無紅色核信號

? 死細胞：細胞核紅色熒光、無綠色胞質信號

?? 晚期凋亡 / 膜損傷細胞：紅綠雙陽性

2. 設備選型：萊特 LF200 倒置熒光顯微鏡核心適配優勢

LF200整機正面

LF200整機側視

廣州市萊特光電 LF200 系列無限遠校正倒置熒光顯微鏡，適配 Calcein AM-PI 原位活細胞成像，核心硬件優勢匹配染色檢測需求：

1.       超長工作距離聚光系統，兼容各類細胞培養容器

聚光鏡支持48–60mm（單層培養皿）與172mm（細胞工廠 / 多層高通量培養器）兩種工作距離，無需開蓋即可直接觀察貼壁細胞、3D 細胞球、細胞工廠樣本，原位染色無需爬片轉移，減少細胞損傷。

172mm超長工作距離

48-60mm標準工作距離

2.       電動 LED 多通道熒光激發盒，匹配 Calcein/PI 雙通道

集成電動熒光激發模塊，標配FITC（Calcein 綠色）、TRITC（PI 紅色）、DAPI三組濾光通道，電動一鍵切換激發波段，LED 光源即開即用、無需預熱，亮度無級可調，低光毒性適配長時間活細胞動態觀察，規避傳統汞燈高溫損傷細胞樣本。

電動熒光激發盒

Calcein-PI雙色熒光成像效果

3.       大視野人體工學觀察系統，提升樣本篩選效率

10×/22mm 超大視場目鏡（對比常規 18/20mm 視野），單視野容納更多細胞；45° 鉸鏈傾斜雙目鏡筒，長時間觀察頸椎無疲勞；低手位同軸調焦手輪，扭矩可調帶限位鎖，高倍熒光成像不易失焦。

45°傾斜雙目鏡筒

22mm大視場對比示意圖

4.       多功能柔性載物臺，適配多規格培養器皿

同軸鋼絲傳動移動尺，移動平穩帶極限保護；配套 6 孔 / 12 孔 / 24 孔板、培養皿、細胞工廠專用托板，臺面凹槽防培養液濺落物鏡；可拆卸移動尺，臺面平整無遮擋，熒光成像無雜散光干擾。

多功能載物臺托板

載物臺防濺凹槽

5.       全配套成像系統，定量分析一體化

支持 230 萬–2100 萬高靈敏度顯微相機，左下傾 100% 通光成像接口，相機安裝不遮擋目視觀察；配套免費升級成像軟件，可雙通道自動采集、分割活 / 死細胞、自動統計細胞存活率。

LF系列顯微成像相機

6.       明場 + 相襯 + 熒光三合一，一機完成全流程觀察

旋轉式相差轉盤，10×/20×/40× 相襯環一鍵切換，染色前可通過相襯觀察細胞鋪板狀態，染色后同步采集相襯明場 + 雙色熒光圖像，實現細胞形態 + 活力同步分析。

二、實驗前準備

（一）試劑耗材

1.       Calcein AM-PI 活死細胞雙染試劑盒

2.       無血清 DMEM/RPMI 培養基、無菌 PBS 緩沖液

3.       6/12/24 孔細胞培養板、細胞培養皿、細胞工廠

4.       無菌避光離心管、移液器、避光孵育盒

（二）LF200 顯微鏡設備準備

1.       整機通電，開啟機身總電源、透射 LED 光源、電動熒光激發盒；LED 光源無需預熱，直接使用。

2.       根據培養容器選擇聚光鏡檔位：單層培養皿擺入聚光鏡（48–60mm）；細胞工廠擺出聚光鏡（172mm）。

3.       旋轉相差轉盤至 0 檔（明場），選用 10× 長工作距離平場物鏡，低手位調焦手輪歸零限位。

4.       電動熒光盒切換通道預檢查：FITC（綠色）、TRITC（紅色）通道亮度調至 30% 基礎亮度。

5.       安裝對應規格培養皿托板，固定載物臺移動尺。

三、標準化實驗操作全流程（貼壁細胞原位染色，適配 LF200 直接觀察）

步驟 1：細胞樣本預處理

1.       取出藥物 / 造模處理后的貼壁細胞培養板，輕柔吸除培養基，無菌 PBS 緩慢洗滌細胞 1 次，去除血清殘留酯酶（血清酯酶會分解 Calcein AM 造成背景熒光升高）。

2.       洗滌后吸凈 PBS，避免殘留稀釋染色工作液。

步驟 2：Calcein AM-PI 染色工作液配制（現配現用，避光）

以 24 孔板單孔為例：

取 250μL 無血清培養基，加入 Calcein AM 母液至終濃度 2–5μM，PI 母液至終濃度 1–2μM，充分吹打混勻，全程避光操作。

步驟 3：避光孵育染色

1.       每孔加入配制好的染色工作液，覆蓋細胞單層；

2.       培養板置于 37℃避光孵育箱，孵育 15–30min；懸浮細胞可離心重懸染色，孵育后滴加至培養皿觀察。

步驟 4：LF200 倒置熒光顯微鏡成像檢測（核心操作）

細胞相襯原圖

1.       放置樣本：取出染色完成的培養板，無需洗滌（減少細胞脫落），平穩放置于 LF200 多功能載物臺，固定托板防止滑動。

2.       相襯預定位：旋轉相差轉盤至對應物鏡相襯環（10×PH），開啟透射 LED 光源，低手位調焦手輪粗調 + 微調，找到清晰細胞視野，記錄細胞分布區域。

3.       綠色活細胞通道采集（FITC）

電動熒光盒一鍵切換 FITC 激發通道，調節 LED 熒光亮度至熒光信號清晰、無過曝；推拉成像切換拉桿，目視觀察后切換數碼成像模式，采集單通道綠色熒光圖（活細胞胞質亮綠）。

4.       紅色死細胞通道采集（TRITC）

電動切換 TRITC 激發通道，調整亮度匹配紅色核信號，采集單通道紅色熒光圖（死細胞核亮紅）。

5.       多通道疊加成像：軟件自動合并相襯明場、綠色、紅色三通道圖像，直觀區分活 / 死細胞位置。

6.       高倍細節觀察：切換 20×/40× 長工作距離熒光物鏡，微調焦，拍攝單細胞活死狀態細節圖像。

步驟 5：圖像定量分析

1.       成像軟件自動分割綠色陽性活細胞、紅色陽性死細胞；

2.       統計總細胞數、活細胞數量、細胞存活率；

3.       批量保存原始圖像、疊加圖、數據報表，軟件導出實驗數據。

四、LF200 設備操作關鍵注意事項

1.       熒光觀察避光：染色樣本全程避光，LED 熒光亮度由低到高調節，避免強光長時間照射導致熒光淬滅。

2.       聚光鏡適配規范：多層細胞工廠必須將聚光鏡擺出（172mm 工作距離），否則物鏡觸碰培養容器造成設備損傷。

3.       物鏡保護：載物臺凹槽設計可阻擋培養液濺落物鏡，若液體滴落物鏡，立即用無塵鏡頭紙擦拭。

4.       長時間活細胞動態觀測：降低熒光 LED 亮度，縮短單次曝光時間，LF200 低毒 LED 光源可支持 0.5–2h 連續動態拍攝，無明顯細胞光毒性。

5.       通道切換邏輯：電動熒光盒支持軟件聯動控制，批量多孔板檢測可設置通道自動輪換，提升高通量樣本檢測效率。

五、方案對比優勢（Calcein AM-PI 法搭配 LF200 vs AOPI 法）

1.       細胞安全性：Calcein AM 低細胞毒性，染色后細胞可繼續培養；AO 具有遺傳毒性，染色樣本不可復用，LF200 長時成像僅適配 Calcein AM-PI 體系。

2.       成像維度：Calcein 標記細胞質，LF200 大視場可同步觀察細胞形態 + 活力；AO 僅標記核酸，碎片、凋亡小體易造成計數干擾。

3.       樣本兼容性：LF200 超長工作距離支持細胞工廠、3D 球原位 Calcein 染色成像；AOPI 多用于懸浮細胞快速計數，不適合厚層立體樣本。

4.       實驗拓展：LF200 五通道熒光模塊可疊加 DAPI 核染，實現 Calcein/PI/DAPI 三色共定位，拓展凋亡、共培養細胞檢測。

六、應用場景

本套 LF200+Calcein AM-PI 方案廣泛適用于：

1.       藥物細胞毒性、抗腫瘤藥物篩選；

2.       干細胞、原代細胞活力鑒定；

3.       3D 細胞球、類器官、細胞工廠高通量活力檢測；

4.       細胞缺氧、氧化應激損傷模型評價；

5.       科研院所、高校細胞生物學實驗室、藥企藥效評價平臺。

七、設備配置清單（LF200 電動熒光標準配置）

1.       LF200 無限遠校正倒置熒光顯微鏡主機

2.       45° 鉸鏈式雙目鏡筒，WF10×/22mm 大視場目鏡

3.       長工作距離平場相差熒光物鏡：4×、10×PH、20×PH、40×PH

4.       旋轉擺入式長工作距離聚光鏡（48–172mm 可調）

5.       轉盤式相差模塊（10/20/40× 相襯環）

6.       電動五通道 LED 熒光激發盒（標配 FITC/TRITC/DAPI）

7.       多功能柔性移動載物臺 + 全套培養皿 / 多孔板托板

8.       2100 萬高靈敏度熒光顯微相機 + 成像分析軟件

9.       5W 可調暖色透射 LED 照明系統

八、方案總結

萊特 LF200 倒置熒光顯微鏡依托超長工作距離、電動多通道 LED 熒光、大視野人體工學光學系統、一體化數碼成像四大核心硬件優勢，匹配 Calcein AM-PI 活死細胞雙色染色原位成像需求，整套方案實現樣本原位染色→相襯定位→雙通道熒光采集→細胞活力定量分析全流程標準化操作，兼顧高通量培養容器、3D 立體細胞樣本、長時間活細胞動態觀測場景，相比進口倒置熒光設備具備高性價比、國產化售后、軟件免費升級等優勢，是細胞活力檢測實驗的一站式成像解決方案。