OLYMPUS CKX53倒置顯微鏡熒光升級及
活/死細胞雙色熒光染色（AO/PI法）檢測應用解決方案

基于 CKX-UVBG-E 電動智能熒光模塊的標準化細胞活性評估指南

圖 1：加裝 CKX-UVBG-E 電動智能熒光模塊后的 OLYMPUS CKX53 倒置熒光顯微鏡整機結構

一、 方案背景與 AO/PI 雙色熒光檢測原理

在細胞生物學、組織工程、腫瘤學評估及原代細胞提取過程中，精準鑒別細胞存活狀態是核心檢測步驟。吖啶橙（Acridine Orange, AO）與碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）聯合使用的雙色熒光染色法，能夠特異性標記質膜完整性。相較于傳統臺盼藍明場染色，AO/PI 雙色熒光法能夠有效排除原代樣品中的無核紅細胞、細胞碎片及雜質干擾，展現出更高的檢測特異度與識別準確率。

1.1 AO 與 PI 熒光探針的作用機制

二、 CKX53 倒置顯微鏡熒光升級方案（CKX-UVBG-E 模塊）

常規奧林巴斯 CKX53 顯微鏡主要用于明場及相襯活細胞觀察。通過加裝專為 CKX53 量身開發的 CKX-UVBG-E 電動智能熒光模塊，無需更換顯微鏡主體即可快速升級為高性能倒置熒光顯微平臺：

2.1 高度集成一體化與內陷槽緊湊安裝設計

CKX-UVBG-E 模塊將大功率 LED 光源與熒光激發塊高度集成于單一盒體內，采用了內陷安裝槽與殼體卡扣設計，結構緊湊且外部固定螺絲少。升級后熒光模塊極薄，不遮擋載物臺下方空間，確保物鏡轉換順暢無阻。

圖 2：CKX-UVBG-E 熒光模塊在 CKX53 載物臺下方的內陷式緊湊安裝結構

2.2 電動智能通道切換與 1.44 英寸彩色大屏

模塊配備 1.44 英寸彩色顯示屏，以彩色方柱和百分比數值清晰顯示當前通道狀態及激發光亮度。實體按鍵與編碼標記讓通道切換一目了然；配合防滑指壓旋鈕，單指即可快速旋轉與點擊操控，極大提升了實驗效率。

圖 3：CKX-UVBG-E 1.44英寸彩色大屏與單指防滑多功能操控旋鈕

2.3 長壽命 LED 光源與通道光強智能記憶

采用大功率 LED 光源（使用壽命 > 30000 小時），即開即用，無需傳統高壓汞燈繁瑣的預熱與冷卻等待。系統支持多達 4 色獨立熒光通道，內置通道光強記憶功能——當在 B 通道（檢測 AO 綠光）與 G 通道（檢測 PI 紅光）之間切換時，模塊能自動還原之前設定的光照強度，避免重復微調導致樣本熒光淬滅。

圖 4：CKX-UVBG-E 電動智能熒光模塊外觀與顯示控制面板

2.4 低風噪主動循環散熱與軟件聯動擴展

模塊內置低風噪、低震動風扇進行主動循環風散熱，有效保障 LED 燈珠與濾光片的溫度穩定，防止光譜中心波峰漂移。同時，模塊支持外部協議通訊與軟件聯動控制，可無縫對接電腦端的圖像采集與分析軟件。

三、 AO/PI 雙色熒光檢測標準解決方案流程

為確保升級后的 CKX53 顯微鏡在進行 AO/PI 雙色檢測時獲得高信噪比與高重復性的數據，建議遵循以下標準化實施流程：

步驟 1：試劑準備與細胞樣品洗滌

• 工作液配制：使用無熒光背景的 PBS 緩沖液將 AO 與 PI 母液稀釋成雙染色工作液（推薦終濃度：AO 約 5–10 μg/mL，PI 約 10–20 μg/mL），現配現用并避光保存。

• 樣品洗滌：取待測貼壁或懸浮細胞，用溫育的 PBS 輕輕洗滌 1–2 次，消除培養基成分及殘余血清對熒光染色的干擾。

步驟 2：樣品混合染色與短時溫育

• 染色混合：將 AO/PI 混合工作液與細胞懸液按 1:1 比例充分混合（或直接加至細胞培養孔中），使染色液均勻覆蓋細胞。

• 避光溫育：室溫避光孵育 5–10 分鐘。由于 AO/PI 與核酸結合迅速，建議在 20 分鐘內完成上樣與圖像采集。

步驟 3：CKX53 上樣與明場/相襯快速定位

• 放置樣品：將染色后的血球計數板或培養皿置于 CKX53 載物臺上，使用 Universal Holder 固定。

• 相襯尋焦：開啟 LED 明場光源，利用 iPC 整合相襯系統（4X–40X 切換無需換相襯環）快速尋找代表性視野并完成對焦。

步驟 4：電動智能熒光通道切換與采集

• B 通道采集（活細胞）：通過 CKX-UVBG-E 單指按鍵一鍵切換至 B 激發通道（FITC），LED 光源開啟，采集綠色胞質/胞核熒光圖像（綠光細胞為活細胞）。

• G 通道采集（死細胞）：按下按鍵快速切換至 G 激發通道（TRITC），智能還原預設紅光功率，采集紅色胞核熒光圖像（紅光細胞為死細胞/膜受損細胞）。

步驟 5：圖像合成與細胞存活率定量評估

• 圖像傳輸與疊加：通過相機接口將圖像傳輸至電腦，利用配套分析軟件對 FITC 綠光通道與 TRITC 紅光通道進行 Overlay/Merge 通道疊加。

• 存活率計算：分別統計視野內的綠光活細胞數（Live）與紅光死細胞數（Dead），計算細胞存活率：Vitality (%) = [Live / (Live + Dead)] × 100%。

四、 典型圖像結果與數據評估

在 CKX53 優良光學系統與升級后 CKX-UVBG-E 模塊的支撐下，AO/PI 雙色染色呈現出分明的形態學與熒光光譜特征：

圖 5：升級熒光系統后獲取的高信噪比多色細胞熒光觀察成果圖譜

五、 規范操作注意事項與設備保養建議

5.1 染色觀察時間控制：AO/PI 與核酸結合迅速，染色混合后建議在 20 分鐘內完成觀察。時間過長可能導致 AO 濃度游離變化或 PI 被活細胞少量吞噬造成假陽性。

5.2 LED 激發強度適度調控：充分利用 CKX-UVBG-E 模塊的無級調光與光強記憶功能，在拍攝對比度滿足的前提下適當調低激發功率，減緩熒光探針淬滅。

5.3 風扇風道防堵與清潔：保證熒光模塊側面主動散熱風扇的風道通暢，避免遮擋，定期用干燥氣吹清理風扇網罩灰塵。

5.4 鏡片與部件擦拭維護：若載物臺或物鏡沾染培養基或染色液，應及時用 75% 乙醇濕潤無塵紙輕輕擦拭，保持優良的透光性能與設備衛生。