CKX53倒置熒光顯微鏡在活/死細(xì)胞
雙色熒光染色（AO/PI 法）檢測中的應(yīng)用解決方案

高效 · 高信噪比 · 無菌超凈臺高度契合的標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞活性檢測指南

圖 1：奧林巴斯 CKX53 組織培養(yǎng)倒置熒光顯微鏡整體結(jié)構(gòu)

一、 應(yīng)用背景與 AO/PI 雙色熒光檢測原理

在細(xì)胞生物學(xué)、藥物篩選、腫瘤學(xué)評估及原代細(xì)胞提取過程中，精準(zhǔn)鑒別細(xì)胞存活狀態(tài)是核心檢測步驟。吖啶橙（Acridine Orange, AO）與碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）聯(lián)合使用的雙色熒光染色法，能夠特異性標(biāo)記質(zhì)膜完整性。相比于傳統(tǒng)臺盼藍明場染色，AO/PI 雙色熒光法能夠有效排除原代樣品中的無核紅細(xì)胞、碎片及雜質(zhì)干擾，具有更高的檢測特異度與準(zhǔn)確率。

1.1 AO 與 PI 熒光探針作用機制

二、 CKX53倒置熒光顯微鏡核心硬件與技術(shù)支撐

針對活/死細(xì)胞雙色熒光標(biāo)記檢測中熒光信號易漂白、雜散光干擾及暗室操作繁瑣等難點，CKX53 組織培養(yǎng)倒置顯微鏡提供了高度契合的技術(shù)支撐：

2.1 多通道電動熒光與長壽命大功率 LED 集成光源

CKX53 配備多達 5 個熒光通道觀察能力，標(biāo)準(zhǔn)熒光配置包含大功率 LED 集成光源與電動控制熒光通道轉(zhuǎn)換。LED 光源發(fā)光穩(wěn)定、無預(yù)熱等待且使用壽命長。匹配高透過高截止帶通濾色片鏡組（標(biāo)配 FITC、TRITC、DAPI 鏡組），即便在弱熒光信號下也可獲取高對比度、高信噪比的圖像。

圖 2：CKX53 超凈臺無菌觀察與緊湊便攜機身設(shè)計

2.2 專有“遮光板"（Lighting Shield）設(shè)計，實現(xiàn)明亮環(huán)境下的熒光觀察

傳統(tǒng)熒光顯微鏡強依賴暗室環(huán)境，而 CKX53 專有的遮光板設(shè)計可有效阻擋外界光線干擾，增加熒光圖像反差，使得實驗人員無需關(guān)閉實驗室照明，直接在明亮環(huán)境中即可獲取清晰的 AO/PI 雙色熒光圖像。在需要相襯觀察時，遮光板可輕易移出光路。

圖 3：CKX53 專有遮光板（Lighting Shield）結(jié)構(gòu)

2.3 整合相襯 (iPC) 系統(tǒng)與“反襯" (IVC) 3D 觀察技術(shù)

CKX53 配備 iPC 系統(tǒng)，在 4X 到 40X 之間切換物鏡時無需更換相襯環(huán)即可獲得高反差相襯圖像，大幅提升定位尋找視野的效率。此外，新研發(fā)的反襯（Inversion Contrast, IVC）技術(shù)利用更窄的景深，為透明細(xì)胞標(biāo)本提供無光暈、無定向陰影的 3D 立體清晰圖像。

圖 4：CKX53 預(yù)對中 iPC 滑塊與高級鏡頭組

2.4 超凈臺無菌適配與人體工程學(xué)設(shè)計

CKX53 重量僅約 7kg，外形緊湊且涂有防紫外涂層，可直接置于超凈臺內(nèi)使用超凈臺紫外燈照射消毒。45 度角傾斜光路、前置電源開關(guān)與右側(cè)光路切換鈕，結(jié)合 CKX3-MVR 手動載物臺（旋轉(zhuǎn) 90 度即可移動 96 孔板一個孔位），使細(xì)胞取樣、對焦及拍攝操作順暢自然。

圖 5：CKX53 靈活承載多孔板、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)瓶的通用載物托架

三、 AO/PI 雙色熒光檢測標(biāo)準(zhǔn)解決方案流程

為確保 AO/PI 雙色熒光染色的準(zhǔn)確性、降低背景背景噪音并獲得高重復(fù)性的定量結(jié)果，建議采用以下規(guī)范流程：

步驟 1：試劑配制與樣品洗滌

• 工作液配制：用無熒光背景的 PBS 緩沖液將 AO 與 PI 母液稀釋成雙染色工作液（推薦終濃度：AO 約 5–10 μg/mL，PI 約 10–20 μg/mL），現(xiàn)配現(xiàn)用并避光保存。

• 樣品洗滌：取待測貼壁或懸浮細(xì)胞（或原代細(xì)胞懸液），用溫育的 PBS 輕輕洗滌 1–2 次，消除培養(yǎng)基成分及殘余血清干擾。

步驟 2：樣品混合染色與短時溫育

• 混合染色：將 AO/PI 混合工作液與細(xì)胞懸液按 1:1 比例混合（或直接加至細(xì)胞培養(yǎng)孔中），使染色液充分覆蓋細(xì)胞。

• 避光溫育：室溫避光孵育 5–10 分鐘。由于 AO/PI 與核酸結(jié)合迅速，建議在 20 分鐘內(nèi)完成上樣與圖像采集。

步驟 3：CKX53 快速上樣與相襯/IVC 區(qū)域定位

• 放置樣品：將染色后的血球計數(shù)板、多孔板或培養(yǎng)皿放置于 CKX53 載物臺上，調(diào)節(jié) CKX3-HOUN 通用標(biāo)本夾固定。

• 相襯尋焦：開啟 LED 明場光源，利用 iPC 整合相襯系統(tǒng)（4X–40X 切換無需換環(huán)）或 IVC 模式快速對焦，鎖定代表性目標(biāo)視野。

步驟 4：遮光保護與雙色熒光成像采集

• 展開遮光板：展開 CKX53 專有遮光板，直接遮擋室內(nèi)環(huán)境光。

• FITC 通道（活細(xì)胞）：切換至 FITC 綠光鏡組，開啟大功率 LED 熒光，采集綠色胞質(zhì)/胞核熒光圖像（活細(xì)胞）。

• TRITC 通道（死細(xì)胞）：通過電動控制切換至 TRITC 紅光鏡組，采集紅色胞核熒光圖像（死細(xì)胞/膜受損細(xì)胞）。

步驟 5：圖像融合與存活率定量評估

• 數(shù)據(jù)傳輸與疊加：通過標(biāo)準(zhǔn)相機接口將圖像傳輸至電腦，利用控制軟件對 FITC 與 TRITC 通道進行 Overlay/Fusion 通道疊加。

• 存活率計算：分別統(tǒng)計視野內(nèi)的綠光活細(xì)胞數(shù)（Live）與紅光死細(xì)胞數(shù)（Dead），計算細(xì)胞存活率：Vitality (%) = [Live / (Live + Dead)] × 100%。

四、 典型圖像結(jié)果與數(shù)據(jù)評估

在 CKX53 高質(zhì)量光學(xué)系統(tǒng)與高信噪比 LED 熒光光路支持下，AO/PI 染色呈現(xiàn)出清晰的形態(tài)學(xué)與熒光光譜特征：

圖 6：CKX53 獲取的高反差熒光觀察成像圖譜示例

五、 規(guī)范操作注意事項與設(shè)備保養(yǎng)建議

5.1 孵育時間控制：AO/PI 與核酸結(jié)合迅速，染色后建議在 20 分鐘內(nèi)完成觀察。時間過長可能導(dǎo)致 AO 濃度變化或 PI 被活細(xì)胞少量內(nèi)吞造成假陽性。

5.2 LED 激發(fā)強度調(diào)控：充分利用 CKX53 電動熒光系統(tǒng)的光源調(diào)控功能，在滿足對比度的前提下適度調(diào)低激發(fā)功率，延長熒光抗淬滅時間。

5.3 無菌超凈臺紫外保護：CKX53 機身具備防紫外涂層，置于超凈臺開啟紫外燈滅菌前，請蓋好物鏡防護罩及目鏡蓋，保護光學(xué)鏡片防老化。

5.4 載物臺與部件清潔：載物臺透明中心板如沾染培養(yǎng)基或染色液，應(yīng)用 75% 乙醇濕潤無塵紙輕輕擦拭，避免有機溶劑殘留損傷材質(zhì)。