LF200倒置熒光顯微鏡在活/死細胞
雙色熒光染色（AO/PI 法）檢測中的應用解決方案

基于一體化 LED 熒光激發與低手位高效操作的細胞活性評估指南

圖 1：萊特 LF200 倒置熒光顯微鏡整機結構

一、 應用背景與 AO/PI 雙色熒光檢測原理

在細胞生物學、腫瘤學研究、原代細胞分離提取以及藥物毒理學篩選中，精準鑒別活細胞與死細胞的比例是評估細胞生理狀態的基礎環節。吖啶橙（Acridine Orange, AO）與碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）聯合使用的 AO/PI 雙色熒光染色法，能夠特異性鑒別細胞質膜完整性，在含有雜質、血細胞或細胞碎片的復雜原代樣品中，相較于傳統明場臺盼藍染色展現出更高的特異性與識別準確率。

1.1 AO 與 PI 雙色熒光探針的作用機制

二、 LF200倒置熒光顯微鏡核心硬件與技術支撐

萊特 LF200 倒置熒光顯微鏡采用無限遠獨立校正光學系統與模塊化緊湊機身設計，針對 AO/PI 熒光染色的激發與多通道觀察提供了穩定的技術保障：

2.1 高度集成一體化 LED 熒光激發系統（手動/電動可選）

LF200 熒光激發盒采用光源與激發塊一體化的高度集成設計。內置大功率 LED 光源，支持無級亮度調節，即開即用，消除了傳統汞燈長時間預熱與冷卻等待的困擾。電動控制模式配有大尺寸顯示屏顯示通道信息，具備光強自動記憶與軟件控制功能；最多可配置 5 通道組，標配 FITC（GFP）、TRITC（CY3）及 DAPI 三色模塊，精確匹配 AO 與 PI 的激發發射光譜。

圖 2：LF200 高度集成一體化 LED 熒光激發盒（帶液晶顯示與無級調光）

圖 3：LF200 精確匹配的高透過率熒光濾光塊組（FITC / TRITC / DAPI）

2.2 超長工作距離聚光系統與高通量適應性

LF200 配備旋轉擺入擺出式及升降式聚光系統。聚光鏡擺入時工作距離為 48–60mm，滿足培養皿及多孔板的常規相襯觀察；聚光鏡擺出后，工作距離升至 172mm，可直接對高通量細胞培養器（細胞工廠）或高培養瓶內的細胞進行快速掃描與觀察。

圖 4：LF200 旋轉擺入擺出式聚光鏡（擺出后工作距離達 172mm）

2.3 低手位人體工程學設計與同軸撓性傳動載物臺

LF200 調焦手輪（微調精度 0.002mm）、光路切換拉桿及照明開關均位于低手位水平位置，配合 45° 傾斜的鉸鏈式雙目觀察鏡筒，有效緩解實驗人員長時間觀察帶來的肩頸疲勞。載物臺采用同軸撓性鋼絲傳動，移動平穩無齒條伸出，配有帶凹槽的透明載物圓板，可直觀觀察物鏡位置并防止液體濺污物鏡。

圖 5：低手位同軸調焦手輪（帶刻度與扭矩調節）與左下傾數碼接口設計

2.4 左下傾數碼成像接口與高靈敏度顯微相機

LF200 采用左下傾側向數碼接口，相機安裝位置不遮擋目鏡觀察視角。接口具備 100% 通光率，適配低照度熒光信號采集；可搭配 230–2500 萬像素高靈敏度顯微相機，結合分析軟件實現多通道疊加與自動化計數。

圖 6：LF200 匹配的高靈敏度數碼顯微相機系統

三、 AO/PI 雙色熒光檢測標準解決方案流程

為了在 LF200 顯微鏡下獲得低背景噪音、高信噪比及準確的計數結果，推薦按照以下規范化流程進行操作：

步驟 1：染色工作液配制與樣品洗滌

• 工作液配制：使用無熒光背景的 PBS 緩沖液將 AO 與 PI 母液稀釋成雙染色工作液（推薦終濃度：AO 約 5–10 μg/mL，PI 約 10–20 μg/mL），現配現用并避光保存。

• 樣品洗滌：取待測貼壁或懸浮細胞（或原代細胞懸液），用溫育的 PBS 輕輕洗滌 1–2 次，消除培養基成分及雜質干擾。

步驟 2：樣品混合染色與短時溫育

• 混合染色：將 AO/PI 混合工作液與細胞懸液按 1:1 比例混合（或直接加至細胞培養孔中），使染色液充分覆蓋細胞。

• 避光孵育：室溫避光孵育 5–10 分鐘。由于 AO/PI 與核酸結合迅速，建議在 20 分鐘內完成上樣與圖像采集。

步驟 3：LF200 快速上樣與相襯聚焦

• 放置樣品：將染色后的血球計數板、載玻片或培養皿放置于 LF200 柔性移動尺載物臺上，使用適配托板固定。

• 明場/相襯定位：開啟暖色 LED 明場光源，轉動相襯盤切入對應相襯環（10X 或 20X），利用低手位調焦手輪快速調整焦距，鎖定代表性視野。

步驟 4：多通道熒光圖像采集

• 切換 FITC 通道（活細胞）：通過電動/手動控制將熒光激發盒切換至 FITC 通道，開啟 LED 熒光激發，采集綠色胞質/胞核熒光圖像（綠色發光細胞為活細胞）。

• 切換 TRITC 通道（死細胞）：切換至 TRITC 通道，系統自動還原該通道預設光強，采集紅色胞核熒光圖像（紅色發光細胞為死細胞/膜破損細胞）。

步驟 5：圖像合成與存活率定量分析

• 數據傳輸與疊加：通過左下傾接口的數碼相機傳輸圖像，利用顯微成像分析軟件對 FITC 綠光通道與 TRITC 紅光通道進行 Merge 疊加。

• 活性計算：統計全視野內綠光活細胞數（Live）與紅光死細胞數（Dead），計算細胞存活率：Vitality (%) = [Live / (Live + Dead)] × 100%。

四、 典型圖像結果與數據評估

在 LF200 高質量光學系統與高信噪比 LED 熒光光路支持下，AO/PI 染色呈現出清晰的形態學與熒光特征：

圖 7：LF200 下采集的高信噪比細胞熒光圖譜（亮視野與極低背景噪點）

五、 規范操作注意事項與設備保養建議

5.1 孵育時間嚴格控制：AO/PI 結合快速，混合后建議在 20 分鐘內完成采集。若時間過長，可能導致 AO 濃度游離變化或 PI 被活細胞少量吞噬造成假陽性。

5.2 激發光功率適度調節：利用 LF200 熒光激發盒的無級調光與光強記憶功能，在拍攝對比度滿足要求的前提下適當降低 LED 功率，延長熒光抗淬滅時間。

5.3 液體濺溢防范與清理：載物臺圓板具備凹槽防護設計，若有培養液或染色液溢出，請及時用 75% 乙醇濕潤的無塵紙輕輕擦拭，防止液體滲入下方鏡頭。

5.4 物鏡與透鏡維護：半復平場消色差物鏡透鏡表面需保持潔凈，清洗時應用氣吹去除灰塵，再用蘸有乙醇/醚混合液的無塵紙由中心向外擦拭。