CKX53倒置熒光顯微鏡在活/死細胞雙色熒光染色
（Calcein AM / PI 法）檢測中的應用解決方案

高效 · 高信噪比 · 規范化實驗室活體細胞分析指南

一、 應用背景與檢測原理

在細胞生物學研究、藥物篩選、組織工程及腫瘤學檢測中，精準評估細胞活力與死存狀態是基礎且關鍵的實驗環節。Calcein AM / PI 雙色熒光染色法作為經典的細胞活性檢測手段，能夠同步區分活細胞與死細胞，具有高靈敏度與高直觀性的特點。

1. 熒光探針作用機制

二、 CKX53倒置熒光顯微鏡核心硬件支撐

針對活/死細胞雙色熒光標記檢測中熒光信號弱、易淬滅、暗室操作繁瑣等痛點，CKX53組織培養倒置顯微鏡提供了高度契合的技術方案：

1. 多通道電動熒光與長壽命大功率LED光源

CKX53配備多達5個熒光觀察通道，標準熒光配置采用大功率LED集成光源與電動控制熒光通道轉換。LED光源發光均勻穩定、色彩還原性良好，無需預熱且使用壽命長。高透過、高截止度的帶通濾色片鏡組使得即便在較弱熒光信號下，亦能獲得高對比度、高信噪比的清晰熒光圖像。

2. “遮光板"設計，實現明亮環境下的高反差熒光觀察

傳統熒光顯微鏡觀察強依賴暗室，而CKX53專有的遮光板（Lighting Shield）設計可有效阻擋環境雜散光線的干擾。實驗人員無需頻繁關閉實驗室照明，直接在普通明亮環境下即可獲取高反差的雙色熒光圖像；在需要相襯觀察時，遮光板可快速移出光路，無縫切換觀察模式。

3. 人體工程學與無菌超凈臺高度契合設計

CKX53機身緊湊輕便（重約7kg），表面具備防紫外涂層，可直接放入超凈工作臺內部并通過紫外燈照射消毒。較短的眼點到調焦旋鈕距離、45度傾斜光路及前置電源控制開關，使細胞取樣、調焦與圖像采集過程自然流暢，大幅提升培養箱與顯微鏡之間的快速操作效率。

三、 活/死細胞雙色熒光檢測標準操作流程

為確保染色均勻度、避免活細胞熒光猝滅及獲得定量級成像效果，推薦以下標準化應用流程：

步驟 1：試劑配制與樣品準備

• 工作液配置：將 Calcein AM (儲存液) 與 PI (儲存液) 用無熒光背景的無血清培養基或無鈣鎂PBS按 1:1000 - 1:500 比例稀釋，制成工作染色終濃度（Calcein AM 約 2 μM，PI 約 4 μM）。

• 樣品準備：取待測貼壁或懸浮培養細胞（如96孔板或35mm培養皿中的細胞），用溫育的PBS輕輕洗滌細胞1-2次，除去血清中酯酶成分對 Calcein AM 的干擾。

步驟 2：細胞染色與孵育

• 加入染色液：向細胞樣品中加入適量配制好的 Calcein AM / PI 雙染色工作液，確保覆蓋細胞層。

• 避光溫育：置于 37°C、5% CO? 培養箱中避光孵育 15–30 分鐘。孵育完成后可直接進行觀察（若背景較高，可用PBS輕輕洗滌一次）。

步驟 3：CKX53 顯微鏡快速上樣與定位

• 放置樣品：將培養板或培養皿置于 CKX53 載物臺上，調節 CKX3-HOUN 通用標本夾固定。

• 明場/相襯定位：開啟 LED 明場光源，利用 iPC 整合相襯系統（4X–40X物鏡切換無需更換相襯環）快速尋找目標視野，完成對焦與細胞形態初檢。

步驟 4：雙色熒光成像采集

• 開啟熒光模塊：展開 CKX53 專有遮光板（遮擋明亮環境光）。

• 綠光通道 (Calcein AM)：切至 FITC 濾光鏡組，調低LED激發強度，快速對焦并采集活細胞黃綠熒光圖像（胞質發光）。

• 紅光通道 (PI)：通過電動控制按鈕切至 TRITC 濾光鏡組，采集死細胞紅色熒光圖像（胞核發光）。

• 圖像融合：借助顯微鏡相機控制軟件進行通道疊加，獲得雙色融合對比圖。

四、 結果分析與圖像數據評估

在 CKX53 的高質量光學系統下，Calcein AM / PI 雙色染色呈現出清晰的形態學與熒光光譜特征：

五、 實驗注意事項與顯微鏡維護建議

5.1 染色時間控制：孵育時間過長可能導致 Calcein 滲出胞外增加背景熒光，或 PI 少量被活細胞內吞造成誤判，建議控制在 15–30 分鐘內完成觀察。

5.2 激發光源強度調整：利用 CKX53 的 LED 光源多檔強度調控功能，在滿足拍攝對比度的前提下盡量降低激發光功率，延長熒光抗淬滅時間。

5.3 紫外滅菌防護：CKX53 機身具備防紫外涂層，置于超凈臺內開啟紫外燈滅菌前，請確保蓋好物鏡防護罩及目鏡蓋，保護光學鏡頭防老化。

5.4 清潔維護：載物臺及透明中心板如沾染培養基或染色液，應用 75% 乙醇濕潤無塵紙輕輕擦拭，避免有機溶劑滯留損蝕部件。