ECLIPSE Ts2-FL倒置熒光顯微鏡在活/死細(xì)胞
雙色熒光染色（AO/PI 法）檢測中的應(yīng)用解決方案

基于 LED 復(fù)眼透鏡均勻照明與遮光系統(tǒng)的規(guī)范化細(xì)胞活性分析指南

一、 應(yīng)用背景與 AO/PI 雙色熒光檢測原理

在細(xì)胞毒理學(xué)評估、原代細(xì)胞計(jì)數(shù)、原代組織消化及腫瘤學(xué)研究中，區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞是基礎(chǔ)檢測手段。吖啶橙（Acridine Orange, AO）與碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）聯(lián)合使用的 AO/PI 雙色熒光染色法，能夠特異性鑒別帶有質(zhì)膜損傷的死亡細(xì)胞與質(zhì)膜完整的存活細(xì)胞，尤其在含有大量雜質(zhì)（如紅細(xì)胞、細(xì)胞碎片）的原代樣品中，比傳統(tǒng)臺盼藍(lán)染色具有更高的特異性與準(zhǔn)確度。

1.1 AO 與 PI 熒光探針的作用機(jī)制

二、 Ts2-FL倒置熒光顯微鏡核心硬件與技術(shù)支撐

在雙色熒光定量分析中，視野照度均勻性、信噪比以及操作便捷度直接決定了計(jì)數(shù)的精準(zhǔn)性。ECLIPSE Ts2-FL 倒置熒光顯微鏡通過多項(xiàng)光學(xué)設(shè)計(jì)為 AO/PI 檢測提供支撐：

2.1 LED 光源與內(nèi)置復(fù)眼透鏡，提供無邊緣光衰的落射熒光

Ts2-FL 采用高亮度落射熒光 LED 光源，并在光路中內(nèi)置復(fù)眼透鏡（Fly-eye lens）。復(fù)眼透鏡能夠有效消除發(fā)光中心與邊緣的照度差異，在視野范圍內(nèi)提供高度一致的光強(qiáng)分布，避免因視野邊緣光衰導(dǎo)致活/死細(xì)胞熒光判讀偏差。同時(shí) LED 光源即開即用、無需中心校準(zhǔn)。

2.2 遮光板（Shield Plate）技術(shù)，實(shí)現(xiàn)明亮實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下的高對比度觀察

針對常規(guī)熒光觀察依賴暗室環(huán)境的局限，Ts2-FL 配備了可選的遮光板附件。遮光板能阻擋培養(yǎng)室中的室內(nèi)雜散光，使實(shí)驗(yàn)人員在無需關(guān)閉室內(nèi)照明的情況下，直接觀察并采集高信噪比的 AO/PI 雙色熒光圖像。

2.3 通道光強(qiáng)自動(dòng)記憶與噪聲消除機(jī)制（Noise Terminator）

Ts2-FL 最多可安裝 3 個(gè)落射熒光濾光塊。當(dāng)在 GFP/FITC 通道（觀察 AO 標(biāo)記活細(xì)胞）與 TRITC 通道（觀察 PI 標(biāo)記死細(xì)胞）之間切換時(shí)，系統(tǒng)能自動(dòng)再現(xiàn)之前設(shè)定的各通道激發(fā)光亮度，無需頻繁重新調(diào)節(jié)光強(qiáng)。這既提升了通道切換效率，又有效減緩了熒光探針的淬滅。集成的噪聲消除機(jī)制可吸收額外雜散光，提高背景黑度與熒光對比度。

2.4 纖巧抗振機(jī)身與人體工程學(xué)控制面板

Ts2-FL 采用緊湊型流線機(jī)身（重約 13kg），具備優(yōu)異的抗振特性，可輕松置于超凈工作臺內(nèi)部。透射照明與落射熒光開關(guān)位于前面板，兩側(cè)分別配置透射與熒光亮度調(diào)節(jié)器，避免誤操作。配合高性能機(jī)械載物臺（TS2-S-SM）及多樣化托板，可穩(wěn)定承載多孔板、培養(yǎng)皿及血球計(jì)數(shù)板。

三、 AO/PI 雙色熒光檢測標(biāo)準(zhǔn)解決方案流程

為確保 AO/PI 熒光染色的準(zhǔn)確性、降低背景噪音并獲得高重復(fù)性的檢測結(jié)果，建議采用以下規(guī)范化應(yīng)用流程：

步驟 1：試劑配制與樣品準(zhǔn)備

• 工作液配置：將 AO 與 PI 儲存液用 PBS 緩沖液稀釋配制成雙染色工作液（建議終濃度：AO 約 5–10 μg/mL，PI 約 10–20 μg/mL），避光保存。

• 細(xì)胞樣品準(zhǔn)備：取待測貼壁或懸浮細(xì)胞，用溫育的 PBS 輕輕洗滌，消除培養(yǎng)基成分及細(xì)胞碎片干擾。

步驟 2：細(xì)胞混合染色與溫育

• 加入染色液：按 1:1 或推薦比例將 AO/PI 混合工作液加入細(xì)胞懸液（或直接加入培養(yǎng)孔內(nèi)），使終濃度覆蓋細(xì)胞。

• 室溫避光孵育：室溫下避光孵育 5–10 分鐘。由于 AO/PI 結(jié)合迅速，需在 20 分鐘內(nèi)完成圖像采集與計(jì)數(shù)。

步驟 3：Ts2-FL 快速上樣與相襯定位

• 放置樣品：將染色后的載玻片、血球計(jì)數(shù)板或培養(yǎng)皿置于 Ts2-FL 載物臺上，使用 C-S-HU 通用托板或載玻片托板固定。

• 明場/相襯定位：開啟透射 LED 光源，使用相差或浮雕反差模式（10X 或 20X 物鏡）快速調(diào)整焦距，鎖定代表性視野。

步驟 4：熒光通道切換與圖像采集

• 展開遮光板：展開 Ts2-FL 專有遮光板，阻擋實(shí)驗(yàn)室環(huán)境光。

• GFP/FITC 通道（活細(xì)胞）：切換至綠光濾光塊，開啟落射熒光，系統(tǒng)自動(dòng)再現(xiàn)預(yù)設(shè)光強(qiáng)，采集綠色胞質(zhì)/胞核熒光圖像（綠光細(xì)胞為活細(xì)胞）。

• TRITC 通道（死細(xì)胞）：切換至紅光濾光塊，采集紅色胞核熒光圖像（紅光細(xì)胞為死細(xì)胞）。

步驟 5：圖像疊加與定量數(shù)據(jù)分析

• 圖像傳輸：通過 Side Camera Port 掛載的 Digital Sight 系列相機(jī)（如 DS-Fi2 / DS-Ri2）實(shí)時(shí)傳輸圖像。

• 通道疊加與計(jì)數(shù)：利用 NIS-Elements 圖像分析軟件進(jìn)行多通道疊加（Overlay/Fusion），自動(dòng)或手動(dòng)統(tǒng)計(jì)綠光與紅光細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算細(xì)胞存活率（Vitality %）。

四、 典型圖像結(jié)果與數(shù)據(jù)評估

在 ECLIPSE Ts2-FL 高品質(zhì)光學(xué)系統(tǒng)的支撐下，AO/PI 雙色染色呈現(xiàn)出清晰的形態(tài)學(xué)與熒光光譜特征：

五、 規(guī)范操作注意事項(xiàng)與設(shè)備保養(yǎng)建議

5.1 觀察時(shí)間控制：染色混合后建議在 20 分鐘內(nèi)完成熒光觀察與圖像采集。孵育時(shí)間過長可能導(dǎo)致 AO 濃度變化或 PI 被活細(xì)胞內(nèi)吞造成誤判。

5.2 激發(fā)光功率控制：利用 Ts2-FL 的光強(qiáng)自動(dòng)記憶功能，在滿足圖像拍攝強(qiáng)度的前提下適當(dāng)調(diào)低 LED 激發(fā)功率，以減緩熒光漂白。

5.3 遮光板規(guī)范使用：在明亮室內(nèi)操作時(shí)請確保遮光板置于光路上。遮光板及載物臺表面若沾染染色液，應(yīng)用濕潤無塵紙擦拭干凈。

5.4 鏡片維護(hù)保養(yǎng)：高倍物鏡（如 20X、40X）前透鏡表面需定期檢查，若沾有灰塵或培養(yǎng)基，應(yīng)用氣吹或?qū)Ｓ玫臒o塵紙沾取無水乙醇輕輕擦拭，保持優(yōu)良的透光性能。